豬苓（Polyporus umbellatus）是一種可食用的蘑菇，也是我國常用的菌類藥材之一，至今已有2000多年的藥用歷史，在《神農本草經(jīng)》、《本草綱目》、《本草求真》等典籍中均有記載。豬苓具有利尿、抗菌作用，近年來研究還發(fā)現(xiàn)具有抗癌作用。當前醫(yī)藥衛(wèi)生業(yè)對豬苓的需求量逐年增加。但是，豬苓的野生資源越來越少，而且種植周期較長，單產(chǎn)較低。豬苓具有產(chǎn)生菌核的能力，然而，其菌核形成的分子機制尚不清楚。因此，研究豬苓的生長發(fā)育及其調控機制，發(fā)展優(yōu)質高產(chǎn)的豬苓種系和栽培技術，將有助于緩解豬苓供應緊張的問題。

2023年4月6日，中國中醫(yī)科學院中藥資源中心黃璐琦院士/袁媛研究員課題組的研究成果，發(fā)表在Frontiers in Microbiology期刊上(影響因子6.064)，文章題目為“PuCRZ1, an C2H2 transcription factor from Polyporus umbellatus, positively regulates mycelium response to osmotic stress"。該研究使用DNA親和純化測序(DAP-seq)技術鑒定了豬苓中一個C2H2轉錄因子的結合基序及其靶基因，揭示了PuCRZ1參與調控豬苓菌絲生長以及滲透脅迫耐受的分子機制。

CRZ1（鈣調神經(jīng)磷酸酶反應性鋅指轉錄因子）是C2H2家族轉錄因子，參與Ca²⁺-鈣調神經(jīng)磷酸酶信號通路，具有調節(jié)菌核形成、維持離子穩(wěn)態(tài)和應對脅迫等功能。CRZ1同源物都具有一個或多個特征性C2H2鋅指結構域，且它們的功能和調控基因在不同物種之間存在差異。目前，對于擔子菌CRZ1基因的研究還很少，僅在靈芝中進行過研究。

該研究首先鑒定了豬苓基因組中包含28個C2H2轉錄因子。qRT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)，其中13個基因的轉錄水平在菌絲體和菌核之間存在差異，包括PuCRZ1。PuCRZ1基因全長801 bp，編碼了一個包含266個氨基酸的蛋白質，是一個核定位蛋白。

圖1. 通過DAP-seq鑒定PuCRZ1在全基因組的靶基因。

通過DAP-seq分析，鑒定到了PuCRZ1的保守結合基序為GTGGCG。KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，peak相關基因在抗生素生物合成、次級代謝產(chǎn)物生物合成、類固醇生物合成、自噬和內吞作用等信號通路中顯著富集，并從KEGG通路顯著富集的基因中發(fā)現(xiàn)了12個可能與豬苓菌核形成相關的基因。于是，進一步采用qRT-PCR鑒定到3個在菌絲體和菌核之間存在顯著差異表達的靶基因PuG10、PuG11、PuG12。酵母單雜交（Y1H）和凝膠阻滯實驗（EMSA）進一步驗證了PuCRZ1可以結合到PuG10、PuG11和PuG12的啟動子區(qū)域。

圖2. 在不同處理條件下，轉基因豬苓菌株的菌落形態(tài)和生長速率。

在酵母中過表達PuCRZ1基因后，降低了酵母細胞對NaCl和CaCl₂的敏感性。之后，通過農桿菌介導的遺傳轉化，在豬苓中分別構建了過表達PuCRZ1、PuG10、PuG11和PuG12的轉基因菌株。然后，分別接種到20 mM NaCl、5 mM CaCl_2、150 mM Mannitol培養(yǎng)基上。生長30天后，觀察發(fā)現(xiàn)PuCRZ1過表達菌株在NaCl和CaCl₂培養(yǎng)基中的菌落直徑小于野生型菌株（WT），表明PuCRZ1過表達菌株對Na⁺和Ca²⁺更敏感。PuG10、PuG11、PuG12過表達菌株在NaCl和CaCl₂培養(yǎng)基中的菌落直徑無明顯差別，卻在對照培養(yǎng)基和Mannitol培養(yǎng)基上均明顯大于WT菌株，其中PuG11過表達菌株的菌落直徑最大。這表明PuCRZ1調控的三個靶基因PuG10、PuG11、PuG12均可以提高菌絲體生長速度和對Mannitol脅迫的耐受性。以上結果表明PuCRZ1基因不直接調節(jié)對離子和滲透脅迫的耐受性，而是通過其靶基因對脅迫作出反應。

此外，還發(fā)現(xiàn)PuG11基因編碼的蛋白含有FYVE結構域，這是一種鋅指結合結構域。因此，該研究擴展了對真菌中含有FYVE結構域蛋白的功能和機制的理解。

圖3. CRZ1及其靶基因在Ca2+-鈣調神經(jīng)磷酸酶信號通路中的調控機制圖。

總結：該研究首先將DAP-seq技術應用于藥用真菌的研究，為基因及分子間相互作用研究提供了新的技術借鑒。該研究揭示了PuCRZ1-鈣調神經(jīng)磷酸酶信號通路在豬苓菌絲體生長以及滲透脅迫耐受中起重要作用，彌補了國際上對豬苓CRZ1以及含F(xiàn)YVE結構域蛋白功能研究的空白，也為深入開展豬苓菌核形成機制的研究提供了理論依據(jù)。

參考文獻：Han P, Hua Z, Zhao Y, Huang L, Yuan Y. PuCRZ1, an C2H2 transcription factor from Polyporus umbellatus, positively regulates mycelium response to osmotic stress. Front Microbiol. 2023 Apr 6;14:1131605. doi: 10.3389/fmicb.2023.1131605.

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